实时定量PCR的具体操作步骤是什么？

时间: 2025-05-16 15:31:17

实时荧光定量PCR（qPCR）的具体操作步骤可分为以下关键环节，结合不同实验场景的优化要点：

一、样本制备‌

RNA提取‌

裂解细胞：使用TRIZOL或NucleoZol裂解样本，室温静置溶解。

两相分离：加入氯仿振荡离心，RNA分布于水相上层。

RNA沉淀：水相与异丙醇混合离心，75%乙醇清洗沉淀。

溶解保存：DEPC水溶解RNA，-80℃保存。

DNA去除（可选）‌

使用DNase I处理RNA样本，65℃灭活后电泳验证。

二、反转录（RT）‌

体系配置‌

模板RNA（1μg）、逆转录酶、dNTPs、Oligo(dT)或随机引物。

反应程序‌

42℃ 60分钟（Oligo(dT)）或25℃→42℃分步反应（随机引物）。

三、qPCR反应体系‌

组分 体积/浓度 备注

cDNA模板 1-5μL 稀释至合适浓度

引物（10μM） 各0.5-1μL 产物长度80-150bp

SYBR Green Mix 10-12.5μL 含荧光染料和Taq酶

RNase-free水 补足至20-25μL 避免降解

四、上机运行程序‌

扩增条件‌

预变性：95℃ 30秒（激活酶）。

循环阶段：95℃ 5秒→60℃ 30秒（40-45循环）。

熔解曲线分析‌

60℃→95℃逐步升温，验证产物特异性（SYBR Green法必需）。

五、数据分析‌

阈值设定‌

荧光信号阈值通常设为基线标准偏差的10倍。

Ct值解读‌

Ct值与起始模板量成反比，通过标准曲线或ΔΔCt法定量。

注意事项‌

防污染‌：分区操作（样本制备、PCR配制、扩增区）。

引物验证‌：避免二聚体，可通过电泳或熔解曲线检查。

内参基因‌：选用GAPDH或β-actin等稳定表达基因校正。

如需特定样本（如血液、植物组织）的优化方案，可进一步细化需求。